Молекулярна метод генетични изследвания

За да се изследва и определи варианти на ДНК структура използва молекулен генетичен метод. За всяка ДНК област, която изследва този регион на хромозома, ген или алел, методите се различават. В основата на всеки молекулен генетичен метод включва някои или друга манипулация на РНК и ДНК. Всички тези методи се характеризират с огромно сложност, без лабораторни условия не може да се извърши, а персоналът трябва да е високо квалифициран. Тази работа се извършва на няколко етапа.

етапи

Първо, РНК или ДНК проби да бъдат произведени. Тук молекулно генетичен метод може да се прилага на практика всеки материал: капка кръв, левкоцити, фибробласти култура, лигавица (остъргват), дори и космените фоликули, - ДНК могат да бъдат получени от всяка проба. Подходящо е да се използват всякакви молекулярни генетични методи и техните различни варианти и отдавна изолира ДНК се съхранява замразен. Вторият етап е посветена на натрупването на желаните фрагменти (амплификация) на ДНК, тъй като тя гарантира, полимеразна верижна реакция ин витро (ин витро без участие на жив организъм). В резултат на избраните ДНК фрагмент умножава по този верижна реакция, както и количеството на ДНК увеличава буквално милиони пъти.

Третата стъпка в методите за молекулярно-генетични изследвания се предполага, умножена ДНК ограничение (това фрагментиране, разкъсване или рязане). Ограничаване извършва чрез електрофореза върху полиакриламиден или агарозен гел. Това молекулно генетичен метод за изучаване на ДНК фрагмент позволява на всеки да определена позиция в гела. След това гелът се обработва с етидиев бромид, способни да се свързват към ДНК, облъчване с ултравиолетова светлина, то тогава е възможно да се наблюдава луминисцентни порции. Molecular генетични диагностични методи са различни и многобройни, но първите две стъпки са общи за всички. Но за да се определи ДНК фрагменти, гелът може да бъде оцветен, както и много други съществуващи методи.

вид

Най преки и широко разпространени методи за откриване на микобактерии могат да включват по-горе метод живот молекулен генетичен ДНК. Същността е, че за да се идентифицира сканиране верига материал на специфични фрагменти от ДНК на патогени. Molecular генетични диагностични техники, все още не са по-ефективен начин да се признае такива заболявания като туберкулоза. Използването на полимеразна верижна реакция (PCR), можете да бъдете сигурни, че първоначалната ДНК ще се увеличи броя на копията в един милион пъти, тоест, ще има усилване, и той ще покаже резултатите. Нивото на чувствителност е много висока - повече от деветдесет и пет процента, което е основното предимство на този метод.

Останалите молекулно генетични методи за изследване на ефективността на добив множество копия буквално удвоява, тъй като в този случай пробата за изготвяне показва специфична олигонуклеотидна последователност повишава до сто и шест пъти. Дори диагнозата култура на туберкулоза на дихателната система значително понижаване на чувствителността. Ето защо съвременната медицина се основава на молекулярно-генетични методи за диагностика на туберкулоза. А описан метод е ефективен, особено когато става дума за патогени с висока антигенна изменчивост, да определи, че друг начин е много по-трудно - изисква специални хранителни среди и култивирането дълго време. Биохимични и молекулярно-генетични методи произвеждат много различен ефект върху резултатите.

диагностика на туберкулоза

Маршал PCR диагностика на туберкулоза най-често с помощта на тези ДНК последователности, които са специфични за всички четири типа на заболяването. За да се постигне тази цел често се използват праймери, които откриват последователност се елементи (IS-986, Е-6110), като тези елементи характеризират далекомигриращи видове Mycobacterium туберкулоза и винаги присъстват множество копия в генома. Също извличане на ДНК може да се извърши от чисти култури и клинични (храчки от пациенти) по всеки друг подходящ метод. Например, има метод Boom където лизисния буфер се използва въз основа на тиоцианат гуанидин и силициев диоксид като ДНК носител. Броят на пациентите, които се различават лошото бактериологично увеличава всяка година, и по тази причина в клиничната практика е установила съвсем различно ниво на организация: молекулно-генетичен метод за изследване на ДНК играе важна роля в диагнозата.

Въпреки това, ние трябва да признаем, че това не е без недостатъци. Методът PCR е използването на често носи огромен брой фалшиви положителни резултати, както и причината за това е не само технически грешки, но и особеностите на самия метод. В допълнение, използването на този метод на диагностика за определяне на жизнеспособността на микобактерии, които са били идентифицирани, това е просто невъзможно. Но този недостатък не е най-важното. Молекулярно-генетични методи на PCR диагностика водят до риска от замърсяване на микобактериална ДНК. Изискванията за сертифициране на тази причина, че за PCR лаборатории, предназначено изключително трудно, те се нуждаят от три отделни помещения. PCR технология е модерен и много сложен, той изисква използването на подходящо оборудване и високо квалифициран персонал.

bacterioscopy

Когато резултатите от диагностиката на анализа трябва да се сравни с друга информация: клиничен преглед, радиография, цитонамазка, микроскопия, култура и дори отговор на конкретно лечение са много важни. В тази серия, изследванията PCR е само един от компонентите. Откриване на патогена в ранна диагностика може да бъде най-простите и най-бързите методи - бактериологични.

Има се използва светлинен микроскоп (оцветяване Ziehl-Neelsen) и флуоресцентна (оцветители флуорохроми). Предимството е, скоростта на намазка на резултатите. Но му недостатък е с право се счита за ограничения капацитет поради ниската чувствителност. Въпреки това, този метод е дадена препоръка на СЗО като най-икономичен и земята, за да се открие болни от туберкулоза. Откриване на микобактерии бактериологичен метод има предсказване стойност и оценява количествено бактериална екскреция. Много по-уверен, за да се справят с него молекулярно-генетични методи за изследване на туберкулоза.

култури

По-добро откриване на микобактерии признае културни изследвания. Засяването патологичен материал е направена в средата на яйце: Mordovsky, Фин II, LJ, и други подобни. Критерии за устойчивост на микобактерии до лекарства и косвени доказателства за ефективността на редица микобактерии и техните колонии ин витро, ако се прилага методът на научните изследвания култура. За да се увеличи процентът на изолация на микобактерии ваксинация на патологичен материал се проведе на няколко условия.

Среща на нуждите на многобройните културни, патогени, включително безвъзмездна помощ и течности. Използва се в тази система и растежа автоматизирано измерване тип VANTES. Култури трябва да се държат в инкубатор в продължение на седем до осем седмици. По това време културата с липсата на растеж може да се счита за отрицателно. Най-ефективният начин за откриване на Mycobacterium туберкулоза помисли биологични проби: диагностични материал Infect морски свинчета, които са изключително чувствителни към туберкулоза.

Малко цифри

Интересни област на проучване, което се открива чрез PCR диагностика е да проучи М. туберкулоза - латентна инфекция. Модерната концепция за ТБ инфекция предполага, че от сто души, които са били в контакт с М. туберкулоза, деветдесет и може и да е заразен, но само десет от тях са активно заболяване се развива. Други имат TB имунитет, а защото деветдесет процента от случаите инфекцията остава латентен. Откриване модел е помага молекулно генетичен метод.

Генетиците казват, че петдесет и пет процента от тези, чиито култури патологичен материал са отрицателни, и осемдесет процента от хората, заразени с М. туберкулоза, но не текат рентгенографски прояви на заболяване, PCR положителни отговори, получени. Това е генетично диагностичен метод помага за идентифициране на пациенти с риск от PCR изследвания, с резултатите от анализи (микроскопия и култура) бяха отрицателни, и субклинична инфекция с М. туберкулоза присъства.

съвременни изследвания

Руската Федерация и бактериологични лаборатории използват ускорена метод на абсолютните концентрации: нитрат редуктаза активност на изпитвани от Griess реагент микобактерии. Анти-TB центрове използват метод, който позволява да се определи лекарствена резистентност. Това засяване в течна среда, където автоматизирана радиометрична и флуоресцентни счетоводна система растеж на микобактерии. Такъв анализ се извършва бързо - до две седмици.

Понастоящем се разработват нови методи: лекарствена резистентност на микобактерии се измерва на ниво генотип. Изследване на молекулярните механизми на резистентност гени и показва присъствието на микобактерии. Тези гени са свързани с резистентност към някои лекарства. Например, КАСА гени, Inha, katG устойчиви на изониазид, rpoB ген - рифампицин 16Sp РНК гени и rpsL - стрептомицин, emb1 - да етамбутол, GyrA - флуорохинолон и така нататък.

мутации

Модерният диагнозата значително увеличен метода на молекулно генетично ниво за изследване на ДНК и се оставя да се извърши мащабни изследвания на мутации в целия си спектър. Сега ние знаем, че най-честите мутации в 516, 526 и 531 кодони генна rpoB и идентифицирани устойчивостта на различни лекарства. Има цял набор от методи за определяне типа на микобактерии, използвайки не само традиционни методи - биохимични, биологични и културни, но и широко използвани съвременни молекулярно-генетични техники. Вече има адекватна и предоставяне на точна диагноза метода за откриване на моногенни болести. Те се основават на ДНК изследвания в областта на точно определен ген. Това обикновено е сложен процес, отнема време и скъпо, но данните, които се предоставят от молекулярен генетичен анализ, е много по-точно, информативно и от данните на всички други анализи.

Отдавна е известно, че ДНК не се променя за целия живот на организма, че е във всеки ядрени клетки odnakova, а това дава възможност да се вземат анализ на абсолютно всички клетки на тялото, на всеки етап от онтогенезата. Увредената ген може да се открие преди появата на първите симптоми на клиничното заболяване пълен мащаб, както и при здрави хетерозиготни хората, но с мутация в гена. Molecular диагностични методи генетично наследствено заболяване позволяват да се разкрие (директен подход, ДНК диагностика), както и да се анализира сегрегацията на заболяването в семейството с маркер локуси ДНК (генетични полиморфизми), които са тясно свързани с увреден ген (т.е., индиректен подход на ДНК диагностика). Пряко или косвено - всички ДНК диагностика се основава на методите за идентифициране на строго определена част на човешката ДНК.

преки методи

Директни методи за ДНК диагноза са когато наследствено заболяване виновник ген е известно, както и известни, и вида си мутации. Например, подходящи директни методи в редица заболявания. Това хорея на Huntington (удължаване CTG-повторения), фенилкетонурия (R408W), кистозна фиброза (delF508, основните мутации) и други подобни. Основното предимство на прекия метод е изцяло притежавано диагностична точност, както и че не е необходимо да се направи ДНК анализ на останалата част от семейството. Ако се установи, мутация в съответния ген, тя позволява точно да одобри диагностика на наследственост, решителност генотип за останалата част от обременени семейството.

Друго предимство на директна диагностика се счита за идентифициране на хетерозиготни носител на лоши мутации от роднини и родители, които са починали от болестта. Това е особено вярно за болести автозомно рецесивни. Недостатъци на директни методи също са на разположение. За да ги приложите, трябва да се знае точно локализиране ненормално ген, екзон-интрон структурата на нейния спектър и нейните мутации на. Не всички моногенни болести днес са получили такава информация. Информативност директни методи не може да се смята за завършена, тъй като един и същ ген може да има голям брой патологични мутация, която причинява развитие на наследствени заболявания.

косвени методи

Индиректни методи в ДНК диагностика се използват изобщо, в други случаи, ако увредената ген не е определена, но само хромозомно, или диагноза на линията не дава резултат (това се случи, ако ген комплекс молекулно организацията или голяма степен, ако има много патологични мутации). Косвените методи извършени сегрегация анализ на полиморфни маркери в алелен семейство. Маркери намерени в същия хромозомен регион или локус е тясно свързани с болестта и представляват делеции или инсерции, точка замествания, повторения и тяхното полиморфизъм се дължи на различно количество на клетките в блока.

Най-удобно за непреки диагноза счита микросателитните и минисателитни полиморфизми, които са широко разпространени в човешкия геном. тяхната стойност, изразена в високо съдържание на информация, ако е увреждане на генетичния разстоянието между показалеца и ген не е твърде голям. В последния случай, точността на оценката се определя до голяма степен от честотата на рекомбинация между полиморфна маркер и щетите. Индиректни диагностични методи също осигуряват задължително предварителна стъпка на алелните честоти на анализирания изследването население сред пациенти и носители на мутации, както и необходимостта от определяне на вероятността от рекомбинация на nonequilibrium и адхезионни маркери и мутантни алели.

други методи

Кратки сегменти на РНК или ДНК, както и един ген визуализират при микроскопско изследване не могат да бъдат, следователно, да се идентифицират мутациите необходими молекулно генетична диагностика. Налице е "Проект за човешкия геном", както и други напредък в молекулярната генетика значително разширена възможността за диагностика на наследствени заболявания - както пре- и постнаталното. Тези методи могат да осигурят ранно откриване и правят прогнози поли- и моногенни болести, чийто дебют се провежда в зряла възраст. За съжаление, поради техническите възможности на молекулярно-генетични изследвания понякога са извън етичните граници, които са настроени по отношение на наследството, особено когато диагнозата е в юношеството и детството.

Структурните и числови хромозомни аномалии са най-честите причини за заболявания и рак, както и много малформации. Хромозомни аберации трябва да бъдат идентифицирани, което е важно за семейно консултиране - да се направи оценка на прогнозата, заедно с репродуктивното риск при бъдещи бременности. анализ на хромозомите е "златен стандарт" за генетична диагностика, но тя е ограничена. Само методите на молекулярната генетичен анализ могат да направят повече, защото се използва за клониране на технологии на базата флуоресцентни маркери, способни тяхната висока чувствителност за идентифициране на фините хромозомни промени, които е невъзможно да се открие класически цитогенетични изследвания. Тези техники все повече разширяват нашите диагностични възможности, когато се изследва, деца с умствена изостаналост, умствена изостаналост, с много други наследствени заболявания.

данни

Това е много важно за човечеството бяха генна структура и функцията на знания, видове променливост, способността за откриване на наследствени заболявания, които се появяват във връзка с развитието на молекулярната генетика. методите са насочени към изследване на ДНК молекулата - и когато е нормално, и когато е повреден. Получаване на последователности дезоксирибонуклеинова киселина от нуклеотиди (ДНК) се простира в етапи от получаването на проби за идентифициране на отделни фрагменти. Изолиране на геномна ДНК от клетките, ограничение (разкъсване), амплификация (клониране), електрофореза на фрагментите (отделяне им електрически заряд и молекулно тегло от агарозен гел). Идентифициране на специфични фрагменти, разположени на повърхността на дискретна ивица.

След получаване на акт специални филтри, през които преминава всеки фрагмент хибридизация с клонирани ДНК фрагменти или синтетични радиоактивни сонди е контрола, която ще бъде равна на всяка проба. Ако промените позицията или дължина в сравнение с пробата, ако нов фрагмент или изчезнали - всичко това предполага, че анализирани гена е претърпял преструктуриране на нуклеотидната последователност. Има осем основни техники на молекулярно-генетични изследвания: секвениране (определяне на ДНК последователност), полимеразна верижна реакция (увеличаване на броя на последователности), получаването на праймери известни гени, ДНК клониране, за производство на рекомбинантни молекули получени протеини поради рекомбинантни молекули, създаване на пълен набор (събиране библиотека) клонирани фрагменти, които са получени чрез използване на ограничения.