Флуоресцентен микроскоп: принципи на метода

Абсорбция и повторно излъчване на светлина допълнителни неорганични и органични течности е резултат от фосфоресценцията или флуоресценцията. Разликата между явления е продължителността на интервала между поглъщане и излъчване на светлина поток. Когато флуоресценцията на тези процеси се появи почти едновременно, докато фосфоресценцията - с известно закъснение.

историческа информация

През 1852, British учен Stokes, първо описан флуоресценция. Той въведе нов термин в резултат на експериментите с флуорит, които излъчват червена светлина под ултравиолетова светлина. Stokes отбележи интересен феномен. Установено е, че дължината на вълната на флуоресцентна радиация е винаги по-голям от потока на светлината на възбуждане.

За да се потвърди хипотезата, през 19 век е имало много експерименти. Те показват, че различни образци флуоресцира под въздействието на ултравиолетова светлина. Сред материали, наред с други неща, са кристали, смоли, минерали, хлорофил, сурови лекарства, неорганични съединения, витамини, масла. Директното използване на бои за биологични тестове, започва през 1930 г.,

Флуоресцентна микроскопия: описание

Някои от материалите, използвани в първата половина на проучванията на 20 век показват висока специфичност. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Благодарение на работата, която не може да бъде постигнато чрез контрастни методи, методът за флуоресцентна микроскопия се превърна в основен инструмент за биомедицински и биологични изследвания. По същия начин се получават важни резултати, и за материали.

? Какви предимства на метода на флуоресцентна микроскопия? Използването на нови материали е станало възможно и подбора на високо специфични клетъчни подмикроскопичните компоненти. Флуоресцентна микроскопия може да открие единични молекули. Разнообразие от бои позволи идентифицирането на няколко елемента едновременно. Въпреки ограничената пространствена разделителна способност на дифракционната граница на оборудването, което, от своя страна, зависи от специфичните свойства на пробата, идентифициране на молекули под това ниво също е напълно възможно. Различни проби след облъчване проявяват автофлуоресценция. Това явление се използва широко в петрология, ботаника, полупроводникови индустрия.

Удобства

Проучване на животински тъкани или патогени често сложни или твърде слаби или много силни неспецифична автофлуоресценция. Обаче стойността в проучвания придобива въвеждане в компонентите на материала възбужда при определена дължина на вълната и излъчващ необходимо интензитета на светлината поток. Флуорохром действат като багрила, способни независимо прикрепени към структури (видими или невидими). По този начин те имат висока селективност към целта и квантов добив.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Флуоресцентна микроскопия е широко използван, тъй като появата на природни и синтетични багрила. Те притежавали определени профили на интензитет на излъчване и възбуждане и насочена към определени биологични цели.

Идентифициране на отделни молекули

Често, в идеални условия, можете да се регистрирате отделен елемент сияние. За това, наред с други неща, е необходимо да се осигури достатъчно ниско ниво на шум на детектора и оптичен заден план. Флуоресцин молекула на неуспех поради фотоизбелващ може да излъчва до 300 хил. Фотони. В ефективност колекция 20% от процеса и да ги регистрират в размер на около 60 хиляди души.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Флуоресцентна микроскопия на базата на лавина фотодиоди или електронен умножение, оставя изследователите да наблюдават поведението на отделните молекули през втората, и в някои случаи дори минути.

сложност

Един от ключовите въпроси в полза на потискането на оптичен фонов шум. Поради факта, че много от материалите, използвани при проектирането на филтри и обективи проявяват някои автофлуоресценция, усилията на учените в ранните етапи са ориентирани към производството на компоненти, които имат ниска флуоресценция. Въпреки това, следващите експерименти са довели до нови заключения. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. По-специално, беше установено, че флуоресцентна микроскопия, въз основа на пълно вътрешно отражение, позволява да се постигне нисък фон и възбуждане светлина с висока интензивност.

механизъм

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Принципите на флуоресцентна микроскопия, въз основа на пълно вътрешно отражение е използването на бързопреходни вълни или краткотраен. Това се случва на границата между медии с различни индекси на рефракция. В този случай, на светлинния лъч преминава през призмата. Той има висок индекс на пречупване параметър.

На призмата, съседен на водния разтвор или стъкло с ниска параметър. Ако лъч светлина насочена към нея под ъгъл, който е по-критичен, лъчът е напълно отразена от интерфейса. Това явление, от своя страна, води до nonpropagating вълни. С други думи, генерирани електромагнитното поле, което прониква в среда с по-нисък индекс на пречупване параметър на разстояние по-малко от 200 нанометра.

затихващи вълни на интензивност на светлината, би било достатъчно, за да възбуди флуорофори. Въпреки това, поради изключително малката си дълбочина, обемът му ще бъде много малък. Резултатът е фон на ниско ниво.

модификация

Флуоресцентна микроскопия се основава на пълно вътрешно отражение, може да се прилага с епи-осветление. Това изисква лещи с висока числена апертура (най-малко 1.4, но е желателно достига 1,45-1,6), и частично осветен поле апарат. Последното се постига с малък размер на светлинното петно. За по-голяма еднаквост с помощта на тънък пръстен, който е блокиран от част от потока. За критичен ъгъл, след което има общо размисъл, ние се нуждаем от висока степен на пречупване на средата за потапяне в лещите и покритието стъклото на микроскопа.